类胡萝卜素生物全成的遗传工程研究

 
类胡萝卜素生物全成的遗传工程研究

李浩明 高蓝

（青岛大学天然色素研究所，青岛，266071）

摘要：类胡萝卜素是一类橘黄，黄色或红色的色素，存于质体内，具有许多不同的生物功能和生物活性，本文综述了近年来用遗传工程手段发行微生物和植物类的胡萝卜 素生物合成途径 ，开发 用来分离所需类胡萝卜素的微生物资源及高类胡萝卜素含量的食用植物的方法，成果和存在的问题。

关键词：类胡萝卜素，遗传工程，生物合成

 

类胡萝卜素具有许多不同的生物功能和生物活性，与人类健康密切相关，能降低许多疾病包括癌症的发病率，对健康、视力是至关重要的。类胡萝L素生物合成的遗传修饰的重要性是易而易见的。本文综述了近年来用遗传工程手段改造微生物和植物类胡萝卜素生物合成途径、开发用来分离所需类胡萝卜素的微生物资源及高类胡萝卜素含量的食用植物的方法、成果和存在的问题。

  类胡萝L素是一类由异戊二烯组成的萜类化合物庀是一类亲脂性化合物，存储于亲脂环境，在质体中合成。典型的C如类胡萝卜素带有环化β—紫罗酮末端基团，其不同位置可被氧、环氧和氢氧基团取代(图1)，分子中的共轭双键与其呈色和生物功能密切相关。类胡萝卜素的显著功能是作为抗氧化剂淬灭单线态氧和捕获氧自由基，类胡萝卜素在工业上用作营养补充剂、食用色素和饲料着色剂。

    商业用的类胡萝卜素大部分是化学合成的，少部分从自然资源中提取，许多重要的类胡萝·卜素在食物中含量很低(如玉米黄质)，玉米黄质和叶黄素是视网膜的重要色素，它们在食物中含量甚微，玉米黄质和叶黄素低摄人容易导致年龄相关视黄斑退化。为了丰富类胡萝卜素的自然资源，研究人员进行了微生物和植物的遗传改造研究，培育用于工业分离类胡萝卜素的微生物和类胡萝卜素含量高、类胡萝卜素种类符合要求的植物工程株。

近年来，在微生物和植物中就类胡萝卜素生物合成途径的遗传修饰、相关基因的克隆、分析、改造等方面做了大量的研究工作，并取得了很大的进展，通过遗传工程方法用不同微生物生产类胡萝L素和经遗传修饰植物类胡萝卜素生物合成途径使其产生所需的类胡萝卜素的研究获得成功。尽管如此，要提高类胡萝卜素含量和产生新类胡萝卜素，仍存在以下几个问：

(1)    工程株原有代谢途径消耗大量类胡萝卜素合成的前体；

(2)    干扰其他代谢途径，影响工程株的正常生长；

(3)    目的产物产生后的存储问题。所以，要使类胡萝卜素产量高就必须提供足够的前体，平衡相关代谢途径的关系，有适当的生物或组织能存储亲脂性产物。

 

一、转基因微生物

  通过遗传工程方法已成功地使不产类胡萝卜素的产朊假丝酵母(Candida utilis)合成类胡萝L素，如番茄红素、β—胡萝卜素和虾青素等。将细菌类胡萝卜素生物合成途径中的相关基因，根据产朊假丝酵母密码子利用情况改造后，转到产朊假丝酵母中表达，用代谢工程方法改变产朊丝酵母甲羟戊酸途径，使其增加萜类化合物前体的供应，用抑制固醇代谢途径的方法减少异戊二烯焦磷酸的消耗，这样得到的工程菌番茄红素的产量达到7．8mg／g干重[5]。

    大肠杆菌是表达外源类胡萝卜素生物合成途径相关基因、生产类胡萝卜素的方便宿主，大部分来源于细菌、真菌和高等植物的类胡萝卜素生物合成相关酶的基因均能在大肠杆菌中表达。另外，现已获得带有不同抗性标记、属不同于不相容性群的质粒，这样就可用它们携带不同基因同时转化大肠杆菌，以便产生类胡罗卜素，其前体供应问题可通过脱氧—D—木酮糖—5磷酸途径的代谢工程来解决。用脱氧—D—木酮糖—5—磷酸合成酶、脱氧—D—木酮糖—5—磷酸还原异构酶和异戊基焦磷酸异构酶基因转化大肠杆菌，并使其表达，结果类

胡萝卜素的产量达到1．5mg／g干重，相当含量的虾青素大肠杆菌工程菌也已获得。

    通过来自不同生物的类胡萝卜素生物合成途径的相关基因的组合，能产生新的类胡萝卜素化合物加1—羟基化无环结构和13个共轭双键的结构，其抗氧化性优于普通类胡萝卜素阳l。另一种获得全新类胡萝L素的方法是分子育种，来源两个欧文氏杆菌的八氢番茄红素脱饱和酶基因体外随机重组后，编码的酶催化八氢番茄红素向3，4，3’，4一四氢番茄红素转化。番茄红素环化酶中的几个氨基酸替换后，催化3，4—二氢番茄红素向toru—lene(3’，4’—didehydro—β，ψ—carotene)转化。

二、转基因植物

  增加植物类胡萝卜素含量、提高其营养价值是这方面研究的主要目的，目前已在以下几个方面获得了成功：(1)通过修饰番茄类胡萝，、素生物合成途径，将番茄红素转化为其他类胡萝卜素；(2)提高油菜种子原有类胡萝卜素的含量；(3)通过转基因的方法使原本不产类胡萝卜素的组织如稻米胚乳产生类胡萝卜素。

    由两分子牦牛儿基焦磷酸缩合成八氢番茄红素是类胡萝L素生物合成途径的第一步，番茄成熟过程中导致番茄红素积累的关键酶是八氢番茄红素合成酶，如果要用遗传工程的办法控制番茄果实中类胡萝卜素的组成的话，遗传修饰该酶的基因是最重要的途径之一。番茄中八氢番茄红素合成酶基因持续高水平的表达，可使其种皮、子叶、胚轴富含类胡萝卜素，在此情况下因类胡萝卜素合成途径竞争使用异戊二烯焦磷酸，使得赤霉素和脱落酸的合成量减少，导致植株变矮。将细菌八氢番茄红素脱饱和酶或—胡萝卜素脱饱和酶基因转到番茄后，转基因番茄果实总类胡萝L素量有所下降，但β—胡萝L素的含量增加3倍，其他类胡萝卜素合成酶特别是内源胡萝卜素脱饱和酶和番茄红素β—环化酶的表达得到加强。

    稻米不含类胡萝卜素，用遗传工程方法使稻米胚乳产生环化类胡萝卜素如β—胡萝卜素需要建立类胡萝卜素生物合成途径中的至少4个反应，包括八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱饱和酶、胡萝卜素脱饱和酶和番茄红素β—环化酶催化的反应。转化是由带有植物八氢番茄红素合成酶基因和细菌八氢番茄红素脱饱和酶基因的质粒进行的，这两个基因加上质体靶序列和麦谷蛋白启动子或花椰菜病毒35S启动子，表达的八氢番茄红素合成酶和八氢番茄红素脱饱和酶完成从耗牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成番茄红素皿纠，令人惊奇的是：产生的类胡萝卜素不是番茄红素，而是叶黄素、玉米黄质、。—胡萝卜素和β—胡萝l、素。显然，番茄红素β—、c—环化酶和β—、ε—羟化酶在转化体内被诱导合成或原本就有表达，如果八氢番茄红素合成酶基因和细菌八氢番茄红素脱饱和酶基因与番茄红素β—环化酶基因共同转化植株，稻米胚乳的β—胡萝L素含量可达1．6μg／g。

    遗传工程方法增加油菜籽类胡萝卜素含量的研究取得了巨大的成功，八氢番茄红素合成酶基因用质体靶序列延长后加上种子特有的启动子，转化植株；如果，成熟种子中的类胡萝卜素含量增加50倍，种胚呈鲜亮橘黄色，而对照植株为绿色胚；转基因植株种子种类胡萝F、素(主要为α—胡萝卜素和β—胡萝卜素)的含量在lmg／g以上，菜籽油中的类胡萝卜素的含量达到2mg／g。

    总之，类胡萝卜素生物合成途径的遗传修饰已用于微生物类胡萝卜素的生产、增加植物类胡萝卜素含量和调节类胡萝卜素的积累。在合适的微生物中生产类胡萝卜素前景很好，新的类胡萝卜素生物合成途径相关基因的克隆、体外修饰和重组以及由产生的不同类胡萝素衍生物，对类胡萝卜素结构与功能的研究非常重要。代谢工程可以解决异戊二烯前体的供应的瓶颈问题，类胡萝卜素的代谢途径完全可以通过遗传工程和代谢工程重新设计，要获得高产量的类胡萝卜素的主要问题是宿主对类胡萝卜素的存贮能力。人们在用遗传工程方法提高植物类胡萝卜素含量和其营养价值方面作了不少的尝试，需要注意的问题是不要干扰其他异戊二烯代谢途径，这可以在靶组织中进行来避免，如果实和种子，这些组织基础代谢弱；同时，在遗传工程中使目的基因处于组织器官特异的启动子控制之下。